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    近日,知名华人科学家张锋教授与同事在《科学》杂志上发表论文,介绍了一种全新的CRISPR应用工具,用以检测核酸。他和James Collins教授团队,联合将CRISPR-Cas13a改造成了灵敏度达到了阿摩尔级(aM,10的负18次方摩尔每升),可以检测单分子的SHERLOCK技术。这一工具能快速检测RNA或DNA分子,灵敏度甚至有望检测出单个核酸,这一重磅研究对于科研与全球公共卫生有着极大的影响该事件很快在生物圈内刷屏了。


就在大家在为张锋大神欢呼雀跃,在为CRISPR-Cas13a叫好的时候。我们发现,让SHERLOCK技术达到阿摩尔级灵敏度的不是CRISPR-Cas13a,是它的搭档,另一个颠覆性的发明重组聚合酶扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)。很少有报道提起她,她就那样默默站在CRISPR-Cas13a背后。


RPA有多厉害?据说可以媲美PCR技术。什么是PCR?著名发明家Kary Mullis因为发明这个技术于1993年获得诺贝尔奖。RPA技术被称为是可以替代PCR的核酸检测技术(由英国公司TwistDx Inc开发)。以此为基础的TwistAmp® 核酸扩增产品,能够在15分钟内进行常温下的单分子核酸检测。该技术对硬件设备的要求很低,特别适合用于体外诊断、兽医、食品安全、生物安全、农业等领域。如果张锋和Collins教授的这项发明最终能造福人类,我们也应该记住RPA的发明人。

常规的PCR也可以扩增特定DNA片段,提高灵敏度,但是PCR对温度的控制有很复杂的要求,要经历高温变性、低温复性还有中温延伸三个步骤。RPA就不需要这么麻烦,它的反应需要三种在常温下有活性的酶,最适温度在37-42℃之间,不需要变性过程,这样就大大加快了扩增的速度。再加上不需要温控设备,两者共同打造了真正便携式的快速DNA扩增技术。


不仅方便快捷,RPA更“迷人”的地方在于扩增量十分高,能够将痕量的核酸(尤其是DNA)模板扩增到能够可以检测到的水平。痕量,顾名思义就是“该物质虽然存在,但只有‘痕迹’,无法用一般方法定量检测,通常含量<0.1mg”,所以大家就知道RPA有多厉害了吧?利用它可以从单分子得到大约1012的扩增产物。而且RPA还不需要复杂的样品处理,及时环境限制,无法提取核酸,也难不倒它[4]。


利用RPA,在室温中,样品中DNA或RNA的含量就可以得到提升,一旦含量增加了,再将DNA转化为RNA。如此,Cas13a就有资格进化成“SHERLOCK”了!

RPA与LAMP对比

  LAMP:环介导等温扩增法的特征是针对目标DNA链上的六个区段设计四个不同的引物然后再利用链置换反应在一定温度下进行反应。反应只需要把基因模板、引物、链置换型DNA合成酶、基质等共同置于一定温度下(60~65℃)、经一个步骤即可完成。

  RPA:主要依赖于三种酶:能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物,能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列,就会发生链交换反应形成并启动DNA合成,对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的DNA链与SSB结合,防止进一步替换。在这个体系中,由两个相对的引物起始一个合成事件。



RPA技术答疑

RPA技术有哪些特性?

  RPA的特性:快速检测 15min进行单分子检测试验, 简易包装 稳定冻干形式试剂. 无需热循环过程 摆脱任何仪器束缚. 便携 设备要求低,贫瘠条件亦能 完成检测

RPA能实现多重化吗?

  可以。RPA技术支持在同一个管中同时进行多个扩增反应。不过,多重化的引物组合需要精心设计,以便每个引物都能同样有效的工作。需要注意的是,RPA反应的引物总量(nmol)最好不要超标太多。如果在一个反应中使用两个以上的扩增引物,就应该控制不同引物的量。另外,我们应当事先考虑好检测多个扩增事件的探针、设备以及荧光团的兼容性。

能否对模板进行定量?

  可以。扩增子达到可检出水平的时间,依赖于反应起始时的模板量。初始模板的拷贝越多,扩增子就越快达到可检出水平。不过,这种定量需要精心的实验安排,确保对照反应是同时开始的。举例来说,可以利用镁离子的添加时间进行控制。因为镁离子一旦进入体系,RPA反应就会开始。

  此外,较慢的扩增过程有助于更精确的定量。我们可以通过调整反应条件或引物设计来减慢RPA的反应速度。

能否进行荧光终点分析?

  可以。这样比较的是反应开始时的荧光和反应结束时的荧光,荧光增强意味着发生了扩增。

能否支持生物素或荧光标记的寡核苷酸?

  支持。在RPA反应中,连有生物素或荧光团的引物与未修饰的引物表现差不多。据悉还没有发现任何差异。

跑胶前需要回收RPA产物吗?

  需要。RPA反应中的物质会干扰琼脂糖电泳,如果不进行产物回收,跑出来的带会出现拖尾。


RPA核酸检测系列最新应用

犬内脏利什曼病POCT检测

A Novel Molecular Test to Diagnose Canine Visceral Leishmaniasis at the Point of Care

A Castellanos-Gonzalez, O.A. Saldarriaga, L. Tartaglino, R. Gacek, E. Temple, H. Sparks, P. C. Melby, B.L Travi

Prduct used:TwistAmp nfo kit

Paper Link:

http://www.ajtmh.org/content/early/2015/07/30/ajtmh.15-0145.abstract

RPA用于全基因组和基因特异性DNA甲基化检测

Colorimetric detection of both total genomic and loci-specific DNA methylation from limited DNA inputs

Eugene J.H. Wee, Thu Ha Ngo, Matt Trau

Prduct used:TwistAmp basic kit

Paper Link:

http://www.clinicalepigeneticsjournal.com/content/7/1/65

埃及血吸虫病RPA扩增及寡色谱测流试纸检测

Isothermal Recombinase Polymerase amplification (RPA) of Schistosoma haematobium DNA and oligochromatographic lateral flow detection

A. Rosser, D. Rollinson, M. Forrest, B. L Webster

Prduct used:TwistAmp basic kit;TwistAmp nfo kit

Paper Link:

http://www.parasitesandvectors.com/content/pdf/s13071-015-1055-3.pdf



来源:奇点网

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